DNA rekombinan teknis, aplikasi dan fundamental

Dia DNA rekombinan (DNA atau rDNA) adalah molekul asam nukleat buatan yang dibuat di laboratorium, dengan mengintegrasikan dua segmen organisme yang menarik. Ini juga dikenal sebagai DNA chimeric, berkat properti hibridanya. Kami tidak menemukan jenis DNA ini di alam.

Metodologi dasar untuk menghasilkannya meliputi: (a) pemilihan DNA putih, dan penyisipannya dalam fragmen DNA lain (umumnya plasmid bakteri); (B) Pengenalan plasmid ini dalam bakteri, (c) pemilihan bakteri melalui antibiotik dan akhirnya (d) ekspresi gen.

Sumber: Pixabay.com

Teknik ini memanfaatkan permainan enzim yang memungkinkan Anda untuk menyalin dan menempelkan fragmen DNA spesifik ke uji coba peneliti.

Tujuan dari teknologi rekombinan, dalam banyak kasus, adalah ekspresi protein (yang dikenal sebagai protein rekombinan) yang diinginkan oleh ahli biologi molekuler untuk penyelidikan di masa depan atau untuk membuat protein nilai komersial dan terapeutik - seperti insulin manusia, misalnya.

[TOC]

Dasar -dasar teknik DNA rekombinan dan penggunaannya dalam rekayasa genetika

Dogma sentral biologi molekuler

Semua makhluk organik yang kita tahu berbagi beberapa karakteristik. Salah satunya adalah sifat bahan genetik dan cara protein diproduksi - proses yang dikenal sebagai "dogma" sentral dari biologi molekuler.

Dengan pengecualian sepasang virus, semua organisme menyimpan informasi genetik dalam DNA (asam deoksiribonukleat), dikumpulkan sangat kompak dan terorganisir dalam nukleus sel.

Untuk ekspresi gen, molekul DNA ditranskripsi ke RNA messenger, dan yang terakhir diterjemahkan ke dalam bahasa asam amino, blok struktural protein.

Apa itu DNA rekombinan?

Antara 70 -an dan 80 -an, ahli biologi molekuler mulai memanfaatkan proses yang secara alami terjadi di dalam sel dan berhasil mengekstrapolasi mereka ke laboratorium.

Dengan cara ini, gen hewan (vertebrata, misalnya) dapat dimasukkan ke dalam segmen DNA dari bakteri; atau DNA bakteri dapat dikombinasikan dengan DNA virus. Dengan demikian, kita dapat mendefinisikan DNA rekombinan sebagai molekul yang terdiri dari DNA dari dua organisme yang berbeda.

Setelah molekul hibrida atau rekombinan ini dibuat, kami melanjutkan ke ekspresi gen bunga. Dengan kata itu ekspresi Kami ingin merujuk pada proses terjemahan protein.

Dapat melayani Anda: monohíbrid

Enzim pembatasan dan liga: Kunci proses tersebut

Elemen kunci untuk mengembangkan teknologi DNA rekombinan adalah penemuan enzim pembatasan.

Ini adalah molekul protein yang menunjukkan kemampuan untuk berpisah menjadi DNA (nucleas) dalam urutan konkret, berfungsi sebagai "gunting molekuler". Fragmen yang dihasilkan oleh enzim ini disebut fragmen pembatasan.

Enzim ini dapat menghasilkan dalam potongan simetris urutan putih (di kedua rantai pada ketinggian yang sama) atau potongan asimetris. Aspek kunci dari aksi enzim restriksi adalah bahwa setelah pemisahan rantai "tepi longgar" diperoleh, komplementer ke tepi lain yang dipotong oleh enzim yang sama.

Beberapa contoh adalah Ecor 1 dan SMA 1. Lebih dari 200 jenis enzim pembatasan saat ini diketahui dan tersedia secara komersial.

Agar berguna, gunting harus disertai dengan lem. Tindakan penyegelan DNA ini (sebelumnya diobati dengan enzim restriksi) dilakukan oleh liga.

Teknik: Bagaimana DNA suatu organisme di laboratorium yang dimodifikasi secara artifisial?

Selanjutnya kita akan menjelaskan langkah -langkah utama yang diperlukan oleh teknologi DNA rekombinan. Semua dilakukan oleh para profesional di laboratorium biologi molekuler.

Apa itu "klon"?

Sebelum melanjutkan dengan protokol eksperimental, kita harus memperhatikan bahwa dalam biologi molekuler dan bioteknologi istilah "klon" dan kata kerja "clonar" banyak digunakan. Ini bisa menyebabkan kebingungan.

Dalam konteks ini, kami tidak merujuk pada kloning semua Suatu organisme (seperti dalam kasus dolly domba yang terkenal, misalnya), tetapi untuk kloning fragmen DNA, yang bisa menjadi gen. Yaitu, menghasilkan banyak salinan - secara genetik identik - dari urutan.

1. Isolasi dan mendapatkan DNA

Langkah pertama adalah memutuskan urutan mana yang ingin digunakan. Ini sepenuhnya tergantung pada peneliti dan tujuan karyanya. Kemudian, DNA ini harus diisolasi dan dimurnikan. Metode dan prosedur untuk mencapai hal ini bergantung pada organisme dan jaringan.

Sebagian jaringan umumnya diambil dan menjalani perawatan di buff lisis. Selanjutnya, fragmentasi bahan genetik dalam fragmen kecil dilanjutkan.

2. Vektor kloning

Setelah langkah persiapan, peneliti berupaya memperkenalkan segmen DNA yang menarik dalam vektor kloning. Mulai sekarang ke segmen DNA ini kita akan menyebutnya DNA putih.

Itu dapat melayani Anda: gen dominan: prinsip genetik, metode studi, faktor

Plasmid

Salah satu vektor yang paling banyak digunakan dalam plasmid asal bakteri. Plasmid adalah molekul DNA melingkar ganda yang kita temukan secara alami pada bakteri. Mereka adalah entitas di luar kromosom bakteri - yaitu, mereka ekstrakromosom, dan secara alami ditemukan dalam prokariota ini.

Elemen dasar vektor adalah: (a) asal replikasi, yang memungkinkan sintesis DNA; (B) agen seleksi, yang memungkinkan mengidentifikasi organisme yang membawa plasmid dengan DNA putih, seperti resistensi terhadap antibiotik; dan (c) situs multiklonasi, di mana urutan yang akan dikenali oleh enzim restriksi ditemukan.

DNA rekombinan pertama yang berhasil di laboratorium dikloning dalam plasmid PSC101 dari bakteri DAN. coli. Ini berisi situs pembatasan untuk enzim pembatasan ecori dan gen resistensi terhadap antibiotik, selain asal replikasi.

Penyisipan DNA putih dalam plasmid dilakukan dengan menggunakan alat molekuler enzim dan liga restriksi yang dijelaskan pada bagian sebelumnya.

Jenis vektor

Selain plasmid, DNA dapat dimasukkan ke dalam vektor lain, seperti bakteriofag lambda.

3. Pengenalan DNA rekombinan

Setelah molekul DNA rekombinan (gen minat dalam plasmid atau vektor lainnya) telah diperoleh.

Untuk memperkenalkan DNA asing dalam bakteri, teknik yang disebut transformasi bakteri digunakan, di mana tubuh diserahkan ke pengobatan dengan kation divalen yang membuatnya rentan terhadap pengambilan DNA.

Secara metodologis, kami tidak dapat memastikan bahwa 100% bakteri dalam tanaman kami telah secara efektif mengambil molekul DNA rekombinan kami. Di sinilah bagian dari plasmid yang mengandung resistensi antibiotik ikut bermain.

Dengan demikian, bakteri yang telah mengambil plasmid akan resisten terhadap antibiotik tertentu. Untuk memilihnya, itu akan cukup untuk penerapan antibiotik tersebut dan mengambil yang selamat.

4. Protein "panen"

Setelah memilih bakteri dengan DNA rekombinan kami, kami melanjutkan untuk menggunakan mesin enzimatik inang untuk menghasilkan produk protein yang menarik yang menarik. Saat bakteri direproduksi, plasmid beralih ke keturunannya, sehingga tidak hilang selama divisi.

Prosedur ini menggunakan bakteri sebagai semacam "pabrik" protein. Nanti kita akan melihat bahwa itu telah menjadi prosedur yang sangat relevan dalam pengembangan perawatan medis yang efektif.

Dapat melayani Anda: telofase: apa itu, dalam mitosis, di meiosis

Setelah tanaman siap dan bakteri menghasilkan sejumlah besar protein, sel atau pecahnya sel. Ada berbagai teknik biokimia yang memungkinkan pemurnian protein sesuai dengan karakteristik fisik-kimia mereka.

Dalam konteks eksperimental lain kami mungkin tidak tertarik untuk menghasilkan protein, tetapi kami tertarik untuk mendapatkan urutan DNA sendiri. Jika itu masalahnya, plasmid akan berfungsi untuk penciptaan beberapa salinan fragmen yang menarik minat kita dengan tujuan memiliki jumlah yang cukup dari DNA putih untuk melakukan eksperimen yang relevan.

Aplikasi

Teknologi DNA rekombinan membuka jumlah kemungkinan yang tak terbatas untuk biologi molekuler, bioteknologi, kedokteran dan bidang terkait lainnya. Aplikasi Anda yang paling menonjol adalah sebagai berikut.

Analisis genetik

Aplikasi pertama terkait langsung dengan laboratorium biologi molekuler. Teknologi DNA rekombinan memungkinkan para peneliti untuk memahami fungsi normal gen, dan protein yang dihasilkan dapat digunakan dalam penelitian selanjutnya.

Industri farmasi

Protein yang diproduksi menggunakan prosedur DNA rekombinan memiliki aplikasi dalam pengobatan. Dua contoh yang sangat relevan di lapangan adalah insulin manusia dan hormon pertumbuhan, yang diterapkan pada pasien yang kekurangan protein seperti itu.

Berkat DNA rekombinan, protein ini dapat dihasilkan tanpa perlu mengekstrak dari manusia lain, yang mewakili komplikasi metodologis tambahan dan risiko kesehatan. Ini telah membantu meningkatkan kualitas hidup pasien yang tak terhitung jumlahnya.

Referensi

1. Baca, l. DAN. L., & Álvarez, c. L. C. (2015). Biologi 2. Grup Editorial Patria.
2. Cooper, g. M., Hausman, r. DAN., & Hausman, R. DAN. (2000). Sel: molekul pendekatan (Vol. 10). Washington, DC: ASM Press.
3. Devlin, t. M. (2004). Biokimia: Buku Teks dengan Aplikasi Klinis. Saya terbalik.
4. Khan, s., Ullah, m. W., Siddique, r., Nabi, g., Manan, s., Yousaf, m., & Hou, h. (2016). Peran teknologi DNA rekombinan untuk meningkatkan kehidupan. Jurnal Internasional Genomik, 2016, 2405954.
5. Mindan, f. P., & Mindan, P. (seribu sembilan ratus sembilan puluh enam). Anatomi patologis. Elsevier Spanyol.
6. Tortora, g. J., Funke, b. R., & Case, c. L. (2007). Pengantar Mikrobiologi. Ed. Pan -American Medical.
7. Mereka. J. (1989). Insulin Manusia: Obat Pertama Teknologi DNA. American Journal of Health-System Pharmacy, 46(11_suppl), S9-S11.