Karakteristik proteinase K, aktivitas enzimatik, aplikasi

Itu proteina k Ini adalah enzim yang termasuk dalam kelompok protease serin, yaitu di tengah katalitik aktifnya asam amino serin dan memiliki fungsi memecahkan ikatan peptida dengan hidrolisis. Pada gilirannya, enzim ini milik keluarga protein subtilisin (peptidase S8).

Proteinase K memiliki berat molekul (PM) 28.900 Daltons dan pertama kali terisolasi dalam 1.974 dalam ekstrak jamur Album Engyodontium, sebelumnya dikenal sebagai nama Album Tritirachium Limber.

Struktur molekul proteinase k. Sumber: Lykchiniadis [CC BY-SA 4.0 (https: // createveCommons.Org/lisensi/by-sa/4.0)]

Ini menyajikan kapasitas proteolitik tinggi, ditunjukkan dengan mampu menurunkan keratin yang ada di rambut. Kata keratin dalam bahasa Inggris ditulis "keratin", dari sana datang bahwa itu telah disebut "proteins k".

Karena kekuatannya yang tinggi untuk membagi protein asli, enzim ini berguna dalam berbagai teknik biologi molekuler. Terutama digunakan untuk mengisolasi dan menyiapkan asam nukleat dengan berat molekul tinggi (PM).

Proteinase K bekerja dengan melepaskan DNA nuklir, sambil menghancurkan protein dan tidak aktif untuk RNAS dan DNATE, yaitu, menghilangkan nucleas dalam persiapan DNA dan RNA.

Di sisi lain, telah terlihat bahwa K proteinase dapat menghidrolisis beberapa protein asli yang terdenaturasi, yang telah membuat minat peneliti untuk digunakan dalam studi protein prion (PRPC).

Namun, meskipun kekuatan proteolitiknya tinggi ada protein yang resisten terhadap aksi protein k. Di antara mereka, ada beberapa protein anomali yang disebut prion (PRPSC), yang terkait dengan ensefalopati spongiform yang ditransmisikan.

[TOC]

Karakteristik proteinase k

Proteinase K memiliki struktur tersier yang terdiri dari tiga lapisan, dengan lembaran β dari tujuh rantai medis antara dua lapisan baling -baling. Untuk menjadi bagian dari keluarga peptidase S8 ditandai dengan menyajikan triad katalitik di situs aktifnya, yang urutan berurutannya adalah (ASP, HIS dan Being), yang membedakan mereka dari keluarga peptidase lainnya.

Itu dapat melayani Anda: asam amino protein

Enzim gugus protease serin ini ditandai dengan menghidrolisis ikatan peptida yang dekat dengan gugus karboksilat asam amino alifatik dan aromatik.

Di sisi lain, ia dapat bertindak dengan adanya zat korosif tertentu, seperti natrium dodecilsulfate (SDS), Tris-HCl dan EDTA, yang digunakan untuk membantu denaturasi protein, menyebabkan mereka kehilangan struktur asli mereka.

Ini adalah langkah sebelumnya dalam persiapan protein untuk teknik elektroforesis. Kisaran pH yang bertindak proteinsa k cukup luas (2.0 hingga 12.0), dengan pH optimal antara 7.5 hingga 12.0, dan titik isoelektriknya adalah 8.9. Seperti yang dapat dilihat, itu aktif terhadap kisaran pH yang sangat luas.

Fitur lain yang menonjol dalam proteinase K adalah stabilitasnya dengan adanya suhu tinggi (50 - 60 ° C).

Aktivitas enzimatik

Proteinsa K membutuhkan keberadaan ion kalsium, meskipun tidak mempengaruhi aktivitasnya, jika penting untuk mempertahankan stabilitasnya.

Agar proteinsa K melakukan pencernaan lengkap dari substrat, waktu kontak perkiraan diperlukan antara 5 menit hingga 2 jam.

Namun, dalam pengertian ini Daza dan kolaborator membandingkan kemurnian DNA yang diperoleh pada beberapa waktu paparan terhadap proteinase K, dan menyimpulkan bahwa inkubasi yang berkepanjangan (hingga 24 jam) secara signifikan meningkatkan kualitas DNA.

Sekarang, sehubungan dengan konsentrasi yang digunakan enzim K proteinase dalam protokol yang berbeda, dapat dikatakan bahwa itu sangat bervariasi.

Ini dapat digunakan dari konsentrasi yang sangat rendah (5 μg/mL) hingga 500 μg/mL konsentrasi. Tetapi konsentrasi kerja yang paling sering berkisar antara 50-100μg /mL, terutama untuk pencernaan protein dan nucleas. Meskipun untuk pengobatan jaringan konsentrasi 2 mg/ml diperlukan.

Dapat melayani Anda: Easmothium Sibiricum: Karakteristik, Habitat, Fosil

Aplikasi

Aplikasi mereka sangat luas dan dapat diringkas sebagai berikut:

-Ini digunakan dalam pencernaan protein dan ekstraksi DNA dengan beberapa metode seperti: salting-out, PK-SDS, cethyl-tritetyl ammonium (CTAB), dimodifikasi kalium asetat dan ekstraksi natrium iodida asetat.

-Inaktivasi nukleasas (RNASA dan DNASA).

-Dalam teknik hibridisasi In situ (HIS), untuk membantu pelepasan asam nukleat, selain menghilangkan protein yang tidak diinginkan.

-Modifikasi protein.

-Di tingkat penelitian, dalam berbagai studi.

Keuntungan proteinase K

Berbagai studi perbandingan telah dilakukan antara teknik ekstraksi DNA yang menggunakan k proteinase, dengan orang lain yang tidak menggunakannya dan semua menyimpulkan bahwa ada manfaat yang lebih besar ketika enzim digunakan. Di antara keuntungan, berikut ini dapat disebutkan:

-DNA molekul tinggi, berkualitas tinggi dan kemurnian diperoleh.

-DNA yang diekstraksi stabil hingga 3 bulan.

DNA yang diekstraksi dapat digunakan dalam teknik berikut: Southern blot, reaksi rantai polimerase (PCR), elektroforesis, antara lain.

Protein k resisten proteinase

Berbagai investigasi telah menyimpulkan bahwa prion (protein anomali PRPSC beracun berbeda dari protein PRPC (asli) dengan resisten terhadap aksi proteinase K, sedangkan PRPS sensitif terhadap aksi mereka.

Penulis lain telah menggambarkan bahwa dalam struktur PRPSC ada bagian -bagian sensitif dan yang lainnya tahan terhadap proteinase K. Namun, kedua belah pihak sama -sama beracun dan menular.

Di sisi lain, bastian dan kolaborator pada tahun 1987 mengisolasi 4 protein 28, 30, 66 dan 76 kDa dari semacam Spiroplasma Mirum. Semua ternyata tahan terhadap aksi proteinase K dan juga memiliki reaksi silang dengan beberapa prion.

Dapat melayani Anda: chemotoxis

Diketahui bahwa spesies ini dapat menyebabkan katarak penting dan kerusakan neurologis dan karena temuan ilmiah bastian, di antara penelitian lainnya, ia telah mencoba untuk berhubungan dengan mikroorganisme ini dengan ensefalopati spongiform yang ditransmisikan ditransmisikan.

Namun, etiologi patologi neurologis degeneratif ini tetap dikaitkan dengan prion.

Dalam pengertian ini, Butler dan kolaborator pada tahun 1991 mengidentifikasi dan mengkarakterisasi kelas 40 kDa kDa proteinase -yang resisten dari dua galur dari dua strain Mycoplasma hyorhinis. Patogen ini mempengaruhi babi, menginfeksi jaringan mereka, tetapi dalam hal ini tidak ada reaksi silang dengan penjara yang diuji.

Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan banyak hal yang tidak diketahui dalam hal ini.

Referensi

1. Bastian F, Jennings R, dan Gardner W. 1987. Antisiserum ke reaksi protein fibril scrapie dengan reaksi silang dengan Spiroplasma MiruM Protein fibril. J. Clin. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Evaluasi Ekstraksi DNA dan Metode Pemurnian dari Jaringan Otot yang difiksasi dalam formaldehida mayat yang tidak dikenal.  Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, dan McGarrity G. Identifikasi dan Karakterisasi Protein Protein Khasil-K pada Anggota Mollicutes Kelas.  Infeksi dan Kekebalan, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, dkk. Perbandingan dua protokol ekstraksi DNA Trypanosoma cruzi dibudidayakan dalam medium axhenic. Putaran. Peru. Med. Exp. Kesehatan masyarakat  2014; 31 (2): 222-227. Tersedia di: Scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E dan Palma W. Penentuan efektivitas lima protokol ekstraksi DNA dari material parafined untuk studi molekuler. Rev Méd Medic Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.