Yayasan Imunofluoresensi, Protokol dan Aplikasi

Itu imunofluoresensi Ini adalah teknik imunomarcy yang kuat yang menggunakan antibodi yang disatukan secara kovalen untuk molekul fluoresen untuk mengidentifikasi target spesifik dalam sampel sel yang dipasang pada dukungan padat.

Teknik ini pengamatan mikroskopis dengan spesifisitas kekebalan tubuh, memungkinkan pengamatan sel hidup atau mati yang mungkin memiliki sejumlah kecil antigen. Ini banyak digunakan baik di bidang penelitian dan dalam diagnosis klinis berbagai patologi.

Imunomariness filamen aktin dalam sel kardiomiosit (Sumber: PS1415 [CC BY-SA 4.0 (https: // createveCommons.Org/lisensi/by-sa/4.0)] via Wikimedia Commons)

Teknik kualitatif ini terutama (dengan beberapa varian kuantitatif), harus dilakukan secara khusus dengan visualisasi sampel dengan produk fluorofor, yang merupakan molekul fluoresen yang melekat pada antibodi dan yang mampu menarik diri pada panjang gelombang tertentu tertentu.

Dalam konteks sel, sangat berguna untuk mempelajari ada/tidak adanya dan lokasi subseluler protein. Teknik ini digunakan pada awalnya di bidang klinis untuk diagnosis virus seperti influenza dan selanjutnya untuk banyak penyakit menular lainnya.

Ini adalah teknik sensitivitas yang besar, dan dengan tim mikroskop yang tepat, ia dapat memiliki resolusi yang sangat baik. Itu membutuhkan, untuk pengamatannya, penggunaan mikroskop confocal atau epifluoresensi.

Namun, meskipun sangat populer, Anda dapat menghadirkan beberapa masalah penting tentang mendapatkan fluoresensi spesifik yang menghasilkan "kebisingan" tertentu di latar belakang, yang sering membatasi pembacaan hasil yang tepat.

[TOC]

Dasar

Imunofluoresensi didasarkan pada eksploitasi fenomena biologis dari reaksi interaksi antara antibodi dan antigen. Ini harus dilakukan secara khusus dengan visualisasi atau deteksi reaksi ini ketika molekul fluoresen yang menarik pada panjang gelombang tertentu.

Antibodi adalah protein imunoglobulin yang disekresikan dari sel B aktif, dan secara khusus dihasilkan terhadap antigen, yang dapat digabungkan dengan afinitas dan spesifisitas yang hebat. Imunofluoresensi memanfaatkan imunoglobulin IgG, yang ditemukan larut dalam serum darah.

Antibodi adalah molekul hingga 950 kDa terdiri dari dua peptida pendek (cahaya) dan dua panjang dalam bentuk "y" (berat). Baik rantai ringan dan berat dibagi menjadi dua domain: satu variabel, mampu mengenali antigen, dan konstanta atau dilestarikan, karakteristik masing -masing spesies.

Antigen secara fungsional didefinisikan sebagai molekul yang dapat dikenali oleh antibodi dan sebagian besar protein. Ketika seekor hewan terpapar antigen, limfosit sistem kekebalan tubuh diaktifkan, menghasilkan antibodi spesifik terhadapnya dan berfungsi sebagai sistem pertahanan.

Antigen, seperti protein, misalnya, dapat memiliki lebih dari satu epitop atau tempat pengakuan untuk antibodi, sehingga serum hewan yang terpapar antigen dapat memiliki antibodi poliklonal terhadap daerah yang berbeda dari protein yang sama.

Itu dapat melayani Anda: epidermis bawang

Imunofluoresensi, kemudian, mengeksploitasi kemampuan hewan untuk menghasilkan antibodi poliklonal terhadap antigen spesifik untuk memurnikannya dan kemudian menggunakannya untuk mendeteksi antigen yang sama dalam konteks lain.

Di antara pewarna atau molekul fluoresen yang paling banyak digunakan untuk beberapa teknik imunofluoresensi adalah fluorescein isootiocyanate (FITC), tetramethylrodamine-5 dan 6 (TRITC) isochianate, banyak sianin seperti Cy2, Cy3, Cy5 dan Cy7 dan Dye yang disebut Aleor. Fluor®448.

Protokol

Protokol imunofluoresensi bervariasi tergantung pada banyak faktor, namun dan secara umum, mencakup urutan linier langkah yang terdiri dari:

• Persiapan lembaran dan sel
• Fiksasi sampel
• Permeabilisasi
• Pemblokiran
• Imunotif atau immunomarcaje
• Perakitan dan Pengamatan

-Persiapan

Sampel

Persiapan sampel akan tergantung pada sifatnya dan jenis pengalaman yang harus dilakukan. Selanjutnya, kasus paling sederhana akan dijelaskan, yang menyiratkan penggunaan sel yang ditangguhkan.

Sel suspensi, yaitu dalam media kultur cair, harus terlebih dahulu dipisahkan dari ini dengan sentrifugasi dan kemudian harus dicuci dengan larutan buffer atau “penyangga" isosmotik, yang mempertahankan integritasnya.

Biasanya buffer fosfat-salin digunakan dikenal sebagai PBS, di mana sel-sel itu resuspend.

Dari seprai

Lembar yang digunakan untuk pengamatan mikroskopis, di mana sel akan ditetapkan untuk perawatan hilir yang sesuai, juga harus disiapkan dengan cermat.

Ini tertutup atau "peka" dengan larutan polisin, polimer sintetis yang akan berfungsi sebagai "lem molekuler" antara sel dan dukungan padat, berkat interaksi elektrostatik antara muatan positif dari gugus amino mereka dan beban negatif protein yang menutupi sel.

Fiksasi sampel

Proses ini terdiri dalam melumpuhkan protein yang berada di interior seluler untuk menjaga lokasi spasial mereka tetap utuh. Molekul yang digunakan harus dapat melintasi semua jenis membran sel dan membentuk bingkai dengan protein kovalen.

Formaldehyde dan paraformaldehyde, glutaraldehyde dan bahkan metanol banyak digunakan, dengan mana sampel sel diinkubasi untuk waktu tertentu dan kemudian mencuci dengan larutan buffer isosmotik.

Setelah fiksasi sel, itu terus bergabung dengan mereka ke lembaran yang sebelumnya peka dengan polisin.

Permeabilisasi

Bergantung pada jenis tes yang dilakukan, akan diperlukan untuk permeabilisasi atau tidak sel yang diteliti. Jika apa yang dicari adalah mengetahui lokasi, ada atau tidak adanya, dari protein tertentu pada permukaan sel, permeabilisasi tidak akan diperlukan.

Dapat melayani Anda: phosphatidylinositol: struktur, pelatihan, fungsi

Di sisi lain, jika Anda ingin mengetahui lokasi protein di dalam interior seluler, permeabilisasi sangat diperlukan dan akan terdiri dari sampel yang menginkubasi dengan Triton X-100, deterjen yang mampu membran sel permeabilisasi yang permeabilisasi.

Pemblokiran

Langkah mendasar dalam semua teknik imunologis memblokir. Pada tahap prosedur ini, blokade terdiri dari penutup, di lembaran yang peka, semua lokasi dengan molekul poliesin yang tidak dipatuhi sel -sel yang tidak dipatuhi sel. Artinya, itu mencegah serikat pekerja yang tidak spesifik.

Biasanya untuk solusi pemblokiran dengan albumin whey bovine (BSA) digunakan dalam buffer PBS dan hasil terbaik diperoleh semakin lama waktu inkubasi dengan solusi ini. Setelah setiap langkah, termasuk blokade, perlu untuk menghapus solusi yang tersisa dengan mencuci.

Imunotif atau immunomarcaje

Prosedur imunomariness atau imunomariness akan tergantung terutama jika itu adalah imunofluoresensi langsung atau tidak langsung (lihat nanti).

Jika itu adalah imunofluoresensi primer atau langsung, sampel akan diinkubasi dengan antibodi yang diinginkan, yang harus digabungkan dengan pewarna fluorescent. Prosedur inkubasi terdiri dari membuat pengenceran antibodi dalam larutan yang juga akan dikandung BSA tetapi dalam proporsi yang lebih rendah.

Ketika kasusnya adalah imunofluoresensi sekunder atau tidak langsung, dua inkubasi berturut -turut harus dibuat. Pertama dengan antibodi yang diinginkan dan kemudian dengan antibodi yang mampu mendeteksi daerah konstan imunoglobulin primer. Antibodi sekunder inilah yang disatukan secara kovalen untuk fluorofor.

Teknik ini sangat fleksibel, memungkinkan tanda simultan lebih dari satu antigen per sampel, selama mereka memiliki antibodi primer yang digabungkan dengan fluorofor yang berbeda, dalam kasus imunofluoresensi langsung.

Untuk tanda simultan dalam imunofluoresensi tidak langsung itu perlu.

Seperti blokade, inkubasi dengan antibodi memberikan hasil yang lebih baik semakin besar waktu ini. Setelah setiap langkah, perlu untuk mencuci antibodi berlebih yang tidak bergabung dengan sampel dan dalam imunofluoresensi sekunder perlu diblokir sebelum menambahkan antibodi sekunder.

Teknik tertentu menggunakan pewarna lain yang tidak ada hubungannya dengan imunomariness, seperti pewarnaan DNA nuklir dengan DAPI fluorophore.

Perakitan dan Pengamatan

Selama waktu inkubasi akhir dengan fluorofor perlu bahwa sampel tetap dalam gelap. Untuk pengamatan mikroskop itu biasa.

Teman-teman

Ringkasan Grafik Imunofluoresensi Langsung dan Tidak Langsung (Sumber: Westhayl618 [CC BY-SA 4.0 (https: // createveCommons.Org/lisensi/by-sa/4.0)] via Wikimedia Commons)

Imunofluoresensi langsung atau primer

Ini berkaitan dengan deteksi antigen melalui penggunaan antibodi fluorescent. Keuntungan utama dari penggunaan teknik ini adalah kecepatannya, namun, banyak kasus persatuan yang tidak spesifik dapat terjadi dalam prosesnya, terutama ketika mempelajari serum manusia, karena mereka kaya akan antibodi yang sangat heterogen.

Dapat melayani Anda: 5 cabang bioteknologi utama

Imunofluoresensi tidak langsung atau sekunder

Ini juga dikenal sebagai teknik "sandwich" dan ini menyiratkan pengembangan teknik dalam dua langkah. Yang pertama berkaitan dengan penggunaan antibodi non -fluorescent dan penyatuannya untuk antigen yang diminati.

Terhadap daerah konstan antibodi pertama ini (yang sekarang akan berfungsi sebagai antigen) antibodi kedua yang mampu mengenalinya digunakan, yang terkait dengan molekul fluoresen.

Penampilan sinyal fluoresen akan menjadi hasil dari pengakuan spesifik antara antibodi non -fluorescent pertama dan antigen yang menarik; Kehadiran kondisi antibodi pertama yang dari yang kedua, yang diberi label dan berkat ada atau tidak adanya antigen yang dapat ditentukan.

Meskipun merupakan teknik yang mengkonsumsi lebih lama daripada imunofluoresensi langsung (karena termasuk langkah yang lebih inkubasi), teknik ini tidak menyiratkan desain antibodi fluoresen untuk setiap antigen yang dipelajari, yang dihasilkan, dalam istilah ekonomi, lebih layak.

Selain itu, ini adalah teknik yang lebih sensitif dalam hal amplifikasi sinyal, karena lebih dari satu antibodi sekunder dapat bergabung dengan daerah konstan antibodi primer, sehingga memperkuat intensitas sinyal fluoresen.

Aplikasi

Seperti yang diperhatikan sebelumnya, imunofluoresensi adalah teknik yang sangat fleksibel, yang telah diberikan oleh multiplisitas pada bidang ilmiah dan klinis telah diberikan. Ini dapat digunakan untuk menjawab pertanyaan ekologis, genetik dan fisiologis tentang banyak organisme.

Di antara aplikasi klinis, ini digunakan untuk diagnosis langsung dari beberapa penyakit dermatologis, apakah menggunakan imunofluoresensi langsung atau tidak langsung pada jaringan epitel pasien yang dipelajari.

Teknik imunofluoresensi telah diatur dalam organisme uniseluler seperti ragi untuk memvisualisasikan mikrotubulus intranuklear dan sitoplasma, aktin dan protein terkait, filamen sel 10nm dan konstituen lain dari sitoplasma, membran dan dinding sel dan konstituen lain dari sitoplasma, membran dan sel sel dan konstituen lainnya.

Referensi

1. Protokol abcam, imunositokimia dan imunofluoresensi. Diperoleh dari Abcam.com
2. Greph, c. (2012). Pewarna fluorescent. Diperoleh dari Leica-Microsystems.com
3. Miller, d. M., & Shakest, D. C. (sembilan belas sembilan puluh lima). Mikroskop imunofluoresensi. Di dalam Metode dalam Biologi Sel (Vol. 48, hlm. 365-394). Academic Press, Inc.
4. Odell, i. D., & Masak, D. (2013). Teknik imunofluoresensi. Jurnal Dermatologi Investigasi, 133, 1-4.
5. Pangeran, b. J. R., Adams, a. DAN. M., Druain, d. G., & Brian, K. (1991). Metode imunofluoresensi untuk yeas. Di dalam Metode Enzimologi (Vol. 194, hlm. 565-602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, m., Orsi, e. V, & Widelock, D. (1964). Aplikasi imunoflorensi dalam virologi kesehatan masyarakat. Ulasan Bakteriologis, 28(4), 402-408.
7. Vrieling, e. G., & Anderson, D. M. (seribu sembilan ratus sembilan puluh enam). Imunofluoresensi dalam penelitian fitoplankton: aplikasi dan potensi. J: Phycol., 32, 1-16.