Setengah Löwenstein-Jensen Foundation, Persiapan dan Penggunaan

Dia Löwenstein-Jensen Tengah Ini adalah media padat selektif untuk isolasi dan perkembangan bakteri genus Mycobacterium, seperti Mycobacterium tuberculosis, M. Avium, antara lain, dengan pengecualian spesies leprae, yang tidak dapat dibudidayakan.

Bakteri genus Mycobacterium tidak tumbuh dalam media kultur konvensional, oleh karena itu perlu merancang sarana khusus untuk isolasi. Media asli dibuat oleh Löwenstein dan kemudian dimodifikasi oleh Jensen.

Setengah Löwenstein-Jensen dengan koloni Mycobacterium tuberculosis. Sumber: Agarwal et al / Biomed Central Ltd., Atas perkenan Perpustakaan Gambar Biologi

Modifikasi terdiri dari eliminasi pewarna merah Kongo, menggantinya untuk konsentrasi hijau malachite yang lebih besar. Ini juga mengubah konsentrasi magnesium sitrat dan monopotasik fosfat.

Media Löwenstein-Lose saat ini mengandung pati papate, asparragin, magnetik sitrat, fosfat fase monopo, sulfat magnetik, hijau malachite, asam nalidíxico, sikloheksimid.

Mycobacteria biasanya diisolasi dari situs yang tidak steril, seperti dahak, urin, abses, antara lain. Ini berarti bahwa sebagian besar sampel akan mengandung mikrobiota yang biasa di daerah tersebut, ditambah patogen.

Itulah sebabnya media Löwenstein-Jensen mengandung serangkaian inhibitor dalam komposisinya yang diwakili oleh Malachite Green, Antibiotik dan Anjing.

Selain itu, sampel yang berasal dari situs non-steril harus didekontaminasi dan dinetralkan sebelum ditanam di media Löwenstein-Jensen.

[TOC]

Dasar

Kehadiran telur dan gliserin dalam media Löwenstein-Jensen merangsang pertumbuhan mikobakteri karena mereka menyediakan asam lemak dan protein yang diperlukan untuk pengembangan mikroorganisme ini.

Media Löwenstein-Jensen mengandung Malachite Green, yang merupakan inhibitor mikrobiota yang menyertainya. Tetapi juga mengandung asam nalidíicic (35 μg/mL), yang menghambat mikrobiota negatif Gram, sikloheksimida (400 μg/mL), yang menghambat jamur dan ragi saprofit, dan dihapus (2μ/mL), yang menghambat mikrobiota gram mikrobiota gram (2μ/ml), yang menghambat mikrobiota gram mikrobiota gram mikrobiota gram (2μ/mL), mikrobiota gram mikrobiota gram mikrobiota mikrobiota mikrobiota.

Beberapa rumah komersial lebih suka menambahkan kombinasi antibiotik berikut: Polymixina B 200.000 unit/L, amfoterisin B 10 mg/L, carbenicillin 50 mg/L dan trimetoprima 10 mg/l.

Media ini tidak mengandung agar, oleh karena itu pemadatan media terjadi dengan koagulasi albumin yang ada dalam telur selama sterilisasi.

Persiapan

Beratnya 37,3 g media dehidrasi dalam 600 mL air suling yang sebelumnya telah ditambahkan 12 mL gliserol. Campuran dipanaskan, sering diaduk sampai pembubaran totalnya. Autoclavar Medium pada 121 ° C selama 15 menit.

Dapat melayani Anda: 12 tahap perkembangan manusia dan karakteristiknya

Di sisi lain, suspensi homogen 1000 mL telur segar harus disiapkan dalam kondisi aseptik. Tambahkan suspensi telur pada 600 mL yang disiapkan pada suhu 50 - 60 ° C, hindari gelembung udara.

Solusi antibiotik juga ditambahkan setelah sterilisasi dalam autoklaf.

Tuang medium dalam tabung reaksi steril dengan steker benang. Panaskan tabung pada 85 ° C selama 45 menit dalam posisi miring.

Warna media yang disiapkan berwarna hijau aguamarine dan dapat menghadirkan titik -titik keputihan untuk keberadaan lipid telur.

PH medium harus 7,2 ± 0,2

Simpan tabung kulkas dan terlindungi dari lampu langsung sampai digunakan. Tenggelam sebelum menabur.

Ada modifikasi media yang disebut "Modifikasi Gruft dari Löwenstein Jensen". Ini berisi senyawa yang sama dengan media klasik tetapi RNA-5mg/100 mL ditambahkan, dan sebagai inhibitor mengandung malachite hijau 0,025 g/100 mL, penisilin 50 U/mL dan nalidíico 35 ug/ml asam.

Aplikasi

Media Löwenstein-Jensen digunakan untuk isolasi mycobacteria, dari berbagai jenis sampel. Disarankan untuk melakukan pewarnaan Ziehl-Neelsen ke sampel di mana kehadiran Mycobacteria dicurigai.

Beberapa sampel berasal dari situs steril tetapi yang lain tidak. Sampel non -steril harus didekontaminasi karena kasusnya mungkin:

Dahak

Sampel dahak harus didekontaminasi sebagai berikut: Tentukan jumlah sampel dahak dalam ml dan tambahkan jumlah yang sama dari 4% NaOH dan incube hingga 37 ° C.

Kocok campuran sering selama 30 menit. Selanjutnya sentrifugue pada 3000 rpm selama 30 menit.

Buang supernatan pada larutan desinfektan fenolik. Gunakan sedimen menabur, tetapi pertama pH harus dinetralkan.

Untuk menetralkan sedimen, h digunakan₂Sw₄ pada 5% di hadapan indikator fenol merah sampai mengarah ke pH netral yang berasal dari warna salmon.

Pencucian lambung, pencucian bronkial, dan aspirasi bronkial

Dalam hal ini, sampel harus centrifuge pada 3000 rpm selama 30 menit. Supernatan dibuang dan sedimen digunakan. Untuk mendekontaminasi sedimen, 3 mL 4% NaOH ditambahkan dan sering diaduk pada suhu 37 ° C selama setengah jam.

Dapat melayani Anda: Stroma (histologi)

Centrifuge lagi, supernatan dibuang dan sedimen digunakan. Yang terakhir harus dinetralkan seperti yang dijelaskan dalam sampel dahak.

Air seni

Biarkan sampel di lemari es selama 24 jam. Pisahkan supernatan. Sedimen yang tersisa harus disentrifugasi selama 30 menit pada 3000 RMP. Buang supernatan lagi dan menyusun kembali sedimen dengan 3 mL larutan fisiologis steril.

Tambahkan 3 mL 4% NaOH dan lanjutkan ke dekontaminasi dan netralisasi seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Cairan asites, cairan pleura, cairan serebrospinal

Dalam jenis sampel ini disentrifugasi dan supernatan dibuang. Buat gram ke sedimen atau amati langsung di mikroskop; Jika bakteri tidak diamati, lewatnya dekontaminasi tidak diperlukan dan tidak ada netralisasi.

Dalam hal ini sampel dapat ditabur langsung menggunakan sedimen. Jika ada bakteri, lanjutkan untuk mendekontaminasi dan dinetralkan seperti yang dijelaskan di atas.

Biopsi

Jenis sampel ini harus ditambahkan 5 ml air suling ke centrifuge nanti pada 1500 rpm selama 10 menit. Buang supernatan dan menyentrifugasi sedimen pada 3500 rpm selama 30 menit. Gunakan sedimen untuk menabur media kultur.

Hiophare laryngeal

SWAB harus dimasukkan ke dalam tabung steril yang mengandung bagian yang sama dari air suling dan 4% NaOH. Sapu harus ditekan di dinding tabung sehingga sampel diencerkan dalam cairan. Sentrifuge dan menggunakan sedimen. Menetralkan sedimen seperti yang telah dijelaskan.

Ditabur

Media Löwenstein-Jensen diinokulasi dengan menambahkan 0,5 mL sampel pada permukaan medium. Putar tabung untuk mendistribusikan sampel di seluruh medium. Jangan memakai pegangan platinum.

Anda dapat menabur tabung kedua yang berisi setengah stonebrink untuk mengisolasi Mycobacterium bovis dan spesies lain yang tidak tumbuh di lingkungan Löwenstein-Jensen.

Inkubasi

Tabung yang diinokulasi diinkubasi dalam aerobiosis pada suhu 37 ° C, dengan tutup yang sedikit malas dan cenderung sekitar 5 ° dan dilindungi dari cahaya. Lingkungan dengan karbon dioksida dapat diperkaya di 5-10%. Periksa tanaman dua kali seminggu sampai penampilan koloni.

Itu dapat melayani Anda: eksudat hidung: untuk apa, prosedur, budidaya

Saat sampel telah diserap, tapas disesuaikan. Waktu inkubasi maksimum adalah 8 minggu, jika setelah ini tidak ada pertumbuhan yang dilaporkan negatif.

Qa

Sebagai kontrol kualitas, Anda dapat menggunakan strain berikut:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294,  Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Untuk tiga spesies pertama yang disebutkan, perkembangan yang sangat baik diharapkan untuk M. Fortuitum Pertumbuhan pasti bagus, sedangkan untuk M. Bovis pertumbuhan langka atau nol diharapkan. Sedangkan spesies selain genus Mycobacterium harus sepenuhnya terhambat.

Batasan

Media yang disiapkan harus melindungi diri dari paparan cahaya yang berkepanjangan membuat medium vire dari hijau ke biru, dalam hal ini media tidak dapat lagi digunakan. Ini karena Malachite's Green adalah fotosensitif.

Media, karena mengandung telur, dapat dengan mudah terkontaminasi jika tidak dimanipulasi secara aseptik. Dapat dilarutkan jika terkontaminasi dengan bakteri proteolitik.

Budidaya dan manipulasi bakteri genus Mycobacterium membutuhkan personel yang berkualitas, yang menyadari langkah -langkah biosekuriti yang harus dipenuhi untuk menghindari terkontaminasi atau mencemari orang lain.

HCl tidak boleh digunakan dalam lintasan netralisasi karena pembentukan natrium klorida, yang dapat beracun bagi Koch bacillus.

Sampel harus disimpan didinginkan dan dilindungi dari cahaya selama tidak diproses.

Referensi

1. Laboratorium Francisco Soria Melguizo. 2009. Media selektif Löwenstein-Jensen. Tersedia di: F-Soria.adalah
2. Laboratorium Britania. 2017. Media Löwenstein-Jensen. Tersedia di: Britanialab.com.
3. Laboratorium Neogen. Media Löwenstein-Jensen. Tersedia di: Foodsafety.Neogen.com.
4. "Tengah Löwenstein-Jensen." Wikipedia, ensiklopedia gratis. 20 Nov 2018, 15:15 UTC. 24 Apr 2019, 18:34. Wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis mikrobiologis. Edisi ke -5. Pan -American Editorial S.KE. Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosis mikrobiologis Bailey & Scott. 12 ed. Pan -American Editorial S.KE. Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Tes biokimia untuk identifikasi bakteri pentingnya klinis. Edisi ke -3. Editorial Pan -American. Buenos Aires. Argentina.