Metode Bradford Apa, Prinsip, Reagen, Penggunaan

Dia Metode Bradford Ini adalah metode kolorimetri yang saat ini digunakan untuk estimasi cepat konsentrasi protein total dalam sampel eksperimen biologis. Ini digunakan di berbagai bidang penelitian biologis, medis, veteriner, agronomi, dll.

Ini dikenal sebagai "Metode Bradford" karena pertama kali dijelaskan oleh Marion Bradford pada tahun 1976, dalam publikasi yang berjudul Metode cepat dan sensitif untuk kuantifikasi protein dalam jumlah mikrogram menggunakan prinsip protein-youth serikat.

Foto plakat elisa di mana sampel telah disiapkan untuk kuantifikasi Bradford (Sumber: Helito, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Sejak proposal, metode ini telah dipopulerkan secara populer, karena diakui lebih sensitif daripada metode kuantifikasi protein lainnya (seperti Lowry dan Biuret, misalnya); bentuk kompleks yang lebih stabil dan ekonomis dan mudah dilakukan.

Selain itu, telah ditunjukkan bahwa reagen yang mereka gunakan memiliki sedikit gangguan dalam pengukuran spektrofotometri dalam kondisi yang berbeda.

[TOC]

Prinsip Metode

Metode Bradford didasarkan pada kuantifikasi perubahan warna dalam larutan karena persatuan - dalam kondisi asam - dari molekul protein sampel dengan molekul pewarna khusus: coomassie blue Biru yang cemerlang G250.

Ketika pewarna ini ditambahkan ke larutan protein, ia berikatan dengan molekul -molekul ini melalui gaya elektrostatik dan reaksi ini dibuktikan sebagai perubahan warna coklat kemerahan menjadi biru ke biru.

Protein dan asam amino

Sama seperti tubuh dibentuk oleh banyak sel dan asam nukleat (seperti DNA dan RNA) dibentuk oleh nukleotida, protein dibentuk oleh urutan yang dipesan dari beberapa molekul yang dikenal sebagai asam amino.

Asam amino adalah molekul yang terdiri dari atom karbon sentral di mana 4 gugus kimia berbeda bergabung: atom hidrogen, gugus karboksil, gugus amino dan kelompok atau rantai samping, yang memberikan identitas.

Ada 20 asam amino yang umum untuk semua protein, yang berbeda satu sama lain sehubungan dengan sifat -sifat kelompok sampingnya: ada asam amino basa, asam, kutub, apolar, siklus, aromatik, dll.

Dapat melayani Anda: Hukum Toleransi Shelford: Apa itu dan Contoh

Jumlah karakteristik asam amino ini dan urutan di mana mereka bergabung untuk membentuk struktur protein memberikan masing -masing protein serangkaian karakteristik fisikokimia tertentu, apakah mengenai beban mereka, massa mereka, hidrofobisitasnya, antara lain.

Kompleks Tint-Protein

Metode Bradford, kemudian, mengukur keberadaan residu asam amino dari karakteristik basa dalam sampel biologis, terutama asam amino seperti arginin, lisin dan histidin, yang merupakan yang lebih mudah ditampung dengan Coomassie Blue.

Perubahan warna dikuantifikasi sebagai variasi dalam absorbansi sampel, yang diukur menggunakan spektrofotometer yang disesuaikan dengan panjang gelombang 595 nm.

Apa itu absorbansi?

Ini juga dikenal sebagai kepadatan optik dan menentukan jumlah cahaya yang diserap oleh larutan. Penyerapan ini tergantung pada panjang gelombang cahaya yang digunakan untuk menyinari larutan, karena tidak semua molekul mampu menyerap panjang gelombang yang sama.

Fenomena ini dirangkum dalam undang-undang yang dikenal sebagai Hukum Beer-Lambert, yang menetapkan hubungan antara penurunan jumlah cahaya yang melewati suatu zat dan sifat-sifat zat tersebut.

Misalnya, ketika cahaya ditransmisikan melalui larutan, ada dua ukuran intensitas: intensitas insiden (sebelum melintasi larutan) dan intensitas yang ditransmisikan (umumnya lebih rendah, yang sesuai dengan fraksi cahaya yang tidak diserap oleh larutan).

Hubungan antara kedua nilai adalah apa yang dikenal sebagai pemrosesan dan memiliki nilai antara 0 dan 1 atau dinyatakan dalam persentase istilah.

Absorbansi terkait dengan pemrosesan cara logaritmik, dan hukum Beer-Lambert mengusulkan hubungan linier antara absorbansi larutan dan konsentrasinya, koefisien kepunahan molar dan koefisien optik larutan; Persamaan matematika yang menggambarkan undang -undang ini adalah sebagai berikut:

Dapat melayani Anda: fauna berbahaya: penyebab proliferasi, konsekuensi, kontrol

A (absorbansi) = ε (koefisien kepunahan molar) C (konsentrasi) L (panjang pass cahaya)

Konsentrasi suatu larutan dihitung dengan membersihkan yang tidak diketahui dari persamaan dan melakukan perhitungan yang relevan (C = A/εL)

Apa itu spektrofotometer?

Ini adalah perangkat yang digunakan untuk mengukur jumlah cahaya (tergantung pada panjang gelombang) yang menyerap molekul dalam larutan atau, dengan kata lain, jumlah cahaya yang mereka lewati.

Spektrofotometer bekerja dengan memancarkan sinar cahaya (terlihat atau ultraviolet) yang melewati prisma (atau perangkat yang dikenal sebagai Monokromator Jaringan Difraksi) yang memecahnya dalam panjang gelombang yang berbeda yang mengada -ada, memungkinkan untuk "memilih" panjang tertentu.

Cahaya ini dilewatkan melalui tabung khusus yang berisi sampel yang dianalisis dan kemudian mencapai detektor yang merasakan jumlah cahaya yang ditransmisikan dari sampel tersebut (yang tidak diserap) yang dapat diamati nanti berkat "penerjemah" itu memiliki antarmuka grafis.

The Dye: Coomassie Blue Biru yang cemerlang G 250

Reagen terpenting dari metode ini adalah, tanpa diragukan lagi, pewarna yang digunakan untuk "menandai" protein dalam sampel. Bradford mengusulkan tugasnya karena pewarna ini ada dalam dua cara: satu merah dan satu biru. Bentuk merah menjadi bentuk biru setelah pewarna berikatan dengan protein, membentuk kompleks.

Kompleks biru protein biru memiliki koefisien kepunahan molar yang sangat tinggi, menghasilkan sensitivitas yang lebih besar untuk kuantifikasi konsentrasi protein dalam sampel yang dianalisis.

Reagen

Meskipun solusi yang digunakan untuk metode kuantifikasi ini umumnya dipasarkan dalam wadah tertutup, sudah disiapkan -"Bradford reaktif" -, reagen utama yang digunakan adalah:

- Coomassie Blue Biru yang cemerlang G50 (0.01% b/v)

- Asam fosfat (8.5 % b/v)

- Etanol (4.7% b/v)

Kit Kuantifikasi Protein dengan Metode Bradford (Sumber: Vivo Rolfe, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Seperti dalam metode apa pun dan protokol kuantifikasi protein dengan metode spektrofotometri, perlu untuk memiliki protein "standar" atau "standar" untuk melakukan a Kurva kalibrasi untuk menentukan nilai absorbansi yang terkait dengan konsentrasi protein yang berbeda; Umumnya albumin serum sapi digunakan.

Dapat melayani Anda: agar cokelat

Metode ini terdiri dalam pencampuran volume sampel tertentu masalah dengan volume reagen Bradford tertentu; Tunggu beberapa menit untuk interaksi pewarna-protein dan perubahan warna terbukti dan kemudian diukur dan mencatat nilai absorbansi untuk melakukan perhitungan selanjutnya.

Penggunaan/Aplikasi

Metode Bradford adalah salah satu metode kuantifikasi atau estimasi dari konsentrasi protein yang paling banyak digunakan di dunia, terutama karena biaya yang rendah, dengan kecepatan hasilnya, ke stabilitas besar antara protein dan pewarna yang digunakan, untuk Reproduksibilitasnya dan gangguan minimum bahwa komponen reagen yang digunakan selama pengukuran memiliki.

Metode ini digunakan dalam ratusan aplikasi ilmiah yang berbeda untuk penentuan protein dalam konteks yang berbeda: fisiologis, sitologis, imunologis, klinis, industri (khususnya dalam industri makanan), dll.

Secara eksperimental, metode ini sangat berguna untuk:

• Pantau jumlah protein yang terkandung dalam volume yang secara progresif diperoleh dari kolom kromatografi (dalam kolom afinitas, pertukaran ion, penyerapan, filtrasi gel, antara lain) i.Dan. Menganalisis fraksi protokol pemurnian protein.
• Pantau jumlah protein yang dimuat dalam gel untuk elektroforesis.
• Perkirakan jumlah protein yang diperoleh dalam sistem ekspresi berlebih.

Referensi

1. Bonjoch, n. P., & Tamayo, P. R. (2001). Kuantifikasi Konten Protein Dengan Metode Bradford. Dalam Buku Pegangan Teknik Ekofisiologi Tanaman (PP. 283-295). Springer, Dordrecht.
2. Bradford, m. M. (1976). Metode yang cepat dan sensitif untuk kuantisasi jumlah protein mikrogram menggunakan pengikatan protein-hari utama. Biokimia Analitik, 72 (1-2), 248-254.
3. Kielkopf, c. L., Bauer, w., & Urbatsch, i. L. (2020). Uji Bradford untuk menentukan konsentrasi protein. Cold Spring Harbor Protocols, 2020 (4), PDB-Prot102269.
4. Sapan, c. V., Lundblad, r. L., & Harga, n. C. (1999). Teknik uji protein kolorimetri. Bioteknologi dan Biokimia Terapan, 29 (2), 99-108.
5. Walker, J. M. (Ed.). (seribu sembilan ratus sembilan puluh enam). Buku Pegangan Protein Protein (Vol. seribu sembilan ratus sembilan puluh enam). Sains Springer & Media Bisnis.