DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) Karakteristik, fondasi, penggunaan

Dia DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) Ini adalah pewarna yang dengan sifat fluoresen berfungsi sebagai penanda, yang banyak digunakan dalam teknik mikroskop fluoresensi atau aliran sitometri, antara lain. Fluoresensi yang dipancarkannya berwarna biru cerah, kegembiraannya terjadi antara 455-461 nm (cahaya UV).

Pewarna DAPI dapat melintasi membran sel dari sel mati dengan sangat mudah. Anda juga dapat mewarnai inti sel hidup, tetapi dalam hal ini, konsentrasi ini harus lebih besar.

Struktur Kimia Dyst Fluorescent. Sumber: Gambar: File: DAPI.SVG adalah versi vektor dari file ini. Itu harus digunakan sebagai pengganti gambar raster ini saat tidak lebih rendah/richard wheeler (zephyris) [cc by-sa 3.0 (http: // createveCommons.Org/lisensi/by-sa/3.0/)] gambar yang diedit

Pewarna mampu mengakses DNA sel yang melaluinya memiliki afinitas khusus, bergabung dengan aviditas yang hebat dengan basa nitrogen adenin dan timin. Untuk alasan ini sangat berguna dalam beberapa teknik biologi molekuler.

Senyawa ini termasuk dalam kelompok pewarna indolik dan telah terbukti memiliki sensitivitas yang lebih besar terhadap DNA daripada etidium bromida dan iodida yang berdasar, terutama tentang gel agarosa agar.

Penggunaan pewarna fluoresen ini sangat luas, karena berguna untuk: mempelajari perubahan DNA dalam proses apoptosis (kematian sel) dan karenanya mendeteksi sel dalam proses ini; untuk foto jejak kaki DNA (pencetakan foto DNA); untuk mempelajari kontaminasi bakteri; o Untuk memvisualisasikan segmentasi nuklir.

Ini juga telah digunakan dalam studi pita kromosom, dalam deteksi DNA Mycoplasmas sp, Dalam interaksi DNA-protein, dalam pewarnaan dan penghitungan sel dengan imunofluoresensi dan bahkan mewarnai butiran serbuk sari matang.

[TOC]

Karakteristik

DAPI adalah singkatan dari nama kimianya (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol). Formula molekulnya adalah C₁₆H_limabelasN_5. Ini memiliki berat molekul 350.3. Di dekat kisaran lampu UV (345 hingga 358 nm) eksitasi maksimum kompleks DAPI-ADN terjadi, sedangkan emisi fluoresensi maksimum terjadi antara 455-461 nm.

Pewarna ini ditandai dengan menjadi debu kuning, tetapi struktur yang ditandai dengan fluorofor ini memancarkan cahaya biru terang.

Ini adalah senyawa yang larut dalam air, untuk mempercepat pembubarannya, beberapa panas dapat diterapkan. Itu dapat diencerkan dengan PBS tetapi tidak larut langsung ke dalam ini.

Itu dapat melayani Anda: asam arsenioso (H3SO3): sifat, risiko dan penggunaan

Setelah pewarna telah disiapkan, itu harus disimpan dalam kegelapan, yaitu dilindungi dari cahaya, pada suhu 2 hingga 8 ° C (lemari es). Dalam kondisi ini, pewarna stabil selama lebih dari 3 minggu atau bulan.

Jika lampu dilindungi tetapi stabilitasnya dibiarkan pada suhu kamar hingga 2 atau 3 minggu, tetapi terpapar lampu langsung, kerusakannya sangat cepat. Jika Anda ingin menabung lebih lama, Anda dapat mendinginkan pada -20 ° C didistribusikan dalam alikuot.

Dasar

Warna ini didasarkan pada menghasilkan perekrutan nuklir dalam teknik utama biologi molekuler, seperti: aliran sitometri, mikroskop fluoresensi dan pewarnaan kromosom metafasik atau inti antarmuka, antara lain.

Teknik ini didasarkan pada afinitas besar yang dimiliki pewarna untuk basa nitrogen (adenin dan timin) yang terkandung dalam bahan genetik (DNA) dalam alur minor. Sementara pada tingkat sitoplasma meninggalkan bagian bawahnya sangat sedikit.

Ketika penyatuan pewarna fluoresen ke daerah adenin dan timina DNA terjadi, fluoresensi meningkat secara signifikan (20 kali lebih banyak). Warna yang dipancarkan berwarna biru cerah. Perlu dicatat bahwa tidak ada emisi fluoresensi saat mengikat pasangan basa GC (guanina-citosin).

Penting untuk menyoroti bahwa meskipun juga memiliki afinitas terhadap RNA, itu tidak menyebabkan masalah, karena tingkat emisi energi yang lebih besar dari molekul ini terjadi pada panjang gelombang lain (500 nm), tidak seperti DNA yang melakukannya hingga 460 nm. Selain itu peningkatan fluoresensi sekali terkait dengan RNA hanya 20%.

DAPI lebih banyak digunakan untuk mewarnai sel (tetap) yang Anda jalani, karena untuk mewarnai yang terakhir diperlukan konsentrasi pewarna yang jauh lebih tinggi, ini karena membran sel jauh lebih sedikit permeabel ke DAPI saat hidup.

Pewarna DAPI dapat digunakan dalam kombinasi dengan fluorofor merah dan hijau untuk mendapatkan pengalaman berwarna -warni.

Menggunakan

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) adalah fluorofor yang sangat baik dan karenanya banyak digunakan dalam berbagai teknik dan untuk berbagai tujuan. Penggunaan DAPI dijelaskan di bawah ini dalam teknik utama.

Aliran sitometri

Para peneliti Gohde, Schumann dan Zante pada tahun 1978 adalah yang pertama menggunakan dan mengusulkan DAPI sebagai fluorofor dalam teknik aliran sitometri, memiliki keberhasilan besar karena sensitivitasnya yang tinggi oleh DNA dan intensitas tinggi dalam emisi fluoresensi.

Itu dapat melayani Anda: grup amino (NH2): struktur, properti, contoh

Penggunaan DAPI dalam teknik ini, memungkinkan studi siklus sel, kuantifikasi sel dan pewarnaan sel hidup dan mati.

Meskipun ada pewarna lain, seperti etidium bromida, hoechst oksida, acridine oranye dan propidio iodide, DAPI adalah salah satu yang paling sering digunakan untuk menjadi lebih mudah difoto daripada yang disebutkan di atas.

Untuk teknik ini perlu. Sampel disentrifugasi dan supernatan dibuang.

Sementara waktu melewati pewarna DAPI dengan buffer pewarnaan (Foxp3 dari Biolegend) ke 3 μm.

Sentrifugue Sampel, buang supernatan dan kemudian tutup dengan 1 mL larutan DAPI selama 15 menit pada suhu kamar.

Ambil sampel ke flow cytometer dengan laser kanan.

Aliran mikrofluorometri

Teknik lain di mana DAPI digunakan adalah dalam mikro-fluorometri aliran bersama dengan fluorofor lain yang disebut mitramical. Keduanya berguna untuk diukur.

Hibridisasi In situ 

Teknik ini pada dasarnya menggunakan probe DNA yang ditandai dengan pewarna fluoresen yang bisa menjadi DAPI.

Sampel membutuhkan diperlakukan dengan panas untuk mendenaturalisasi DNA dua -kelas dan mengubahnya menjadi dua rantai monocypenary. Selanjutnya, dihidridisasi dengan probe DNA DNA yang ditandai dengan DAPI yang memiliki urutan yang menarik.

Selanjutnya, dicuci untuk menghilangkan apa yang bukan hibrid, kontras digunakan untuk memvisualisasikan DNA. Mikroskop fluoresensi memungkinkan pengamatan probe hibridisasi.

Teknik ini dimaksudkan untuk mendeteksi urutan spesifik dalam DNA kromosom, mampu mendiagnosis penyakit tertentu.

Teknik cito-molekul ini sangat membantu untuk menentukan detail dalam studi kariotipe. Sebagai contoh, telah membuktikan daerah yang kaya akan pasangan adenosin dan pangkalan timin yang disebut daerah heterokromatik atau pita DAPI.

Dapat melayani Anda: permeabilitas: konsep, unit, faktor, contoh

Teknik ini banyak digunakan untuk studi kromosom dan kromatin pada tumbuhan dan hewan, serta dalam diagnosis patologi prenatal dan hematologis pada manusia.

Dalam teknik ini, konsentrasi DAPI yang direkomendasikan adalah 150 ng/ml selama 15 menit.

Slide yang sudah dipasang harus dilindungi dari cahaya pada 2-8 ° C.

Pewarnaan imunofluoresensi

Sel -sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4%. Jika pewarna lain akan digunakan, DAPI dibiarkan pada akhirnya sebagai perekrutan dan sel -sel dengan solusi PBS selama 15 menit ditutupi. Saat waktu berlalu, siapkan larutan DAPI yang mengencerkan dengan PBS, sehingga konsentrasi akhir adalah 300 μm.

Kemudian kelebihan PBS diekstraksi dan ditutupi dengan DAPI selama 5 menit. Cuci beberapa kali. Lembar diamati dalam mikroskop fluoresensi di bawah filter yang tepat.

Lembar pengaman

Senyawa ini harus dimanipulasi dengan hati -hati, karena itu adalah senyawa yang memiliki sifat mutagenik. Karbon aktif digunakan untuk menghilangkan senyawa larutan air ini yang akan dibuang.

Sarung Tangan, Jubah, dan Lensa Keamanan harus digunakan untuk menghindari kecelakaan dengan reagen ini. Jika kontak atau kontak lendir terjadi, Anda harus mencuci area dengan air yang cukup.

Anda tidak boleh menyalakan reagen ini dengan mulut Anda, gunakan propipet.

Jangan mencemari reagen dengan agen mikroba, karena ini akan menghasilkan hasil yang salah.

Jangan encerkan pewarna DAPI lebih dari yang direkomendasikan, karena kualitas pewarnaan akan berkurang secara signifikan.

Jangan mengekspos reagen untuk mengarahkan cahaya, atau menjaga panas karena mengurangi fluoresensi.

Referensi

1. Brammer S, Toniazzo C dan Poersch L. Cholars yang biasa wirausaha na sitogenetika sayuran. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Tersedia dari: Scielo.
2. Laboratorium Impath. Dapi. Tersedia di: Menarinidiagnostics.com/
3. Laboratorium Cytocell. 2019. Instruksi untuk Penggunaan DAPI. Tersedia di Cycell.com
4. ELAOSEGI A, Sabater S. Konsep dan Teknik dalam Ekologi Sungai. (2009). Editorial rubes, Spanyol. Tersedia di: Buku.Google.bersama.pergi/
5. Novaes R, Penitent A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Penggunaan fluoresensi dalam metode distor yang dimodifikasi untuk memperkirakan jumlah miosit dalam jaringan jantung. Arq. Bra. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Tersedia dari: Scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Kehadiran phytoplasma di pepayo (Carica pepaya) di Meksiko. Majalah Chapingo. Seri Hortikultura, 2011; 17 (1), 47-50. Tersedia di: Scielo.org.